放線菌素D誘導細胞凋亡形態學.ppt

放線菌素D誘導細胞凋亡形態學
適用于教師試講、學校演講、教學課件、說課大賽
誘導細胞凋亡步驟
1、向處于對數增長期細胞加入放線菌素D（1μg/ml），細胞37℃培養箱中培養12小時；
2、將培養瓶中的培養基和懸浮細胞收集到離心管中 自穩平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非
常關鍵的作用：
　　　　蝌蚪尾的消失，骨髓和腸的細胞凋亡，
　　　　脊椎動物的神經系統的發育，
　　　　發育過程中手和足的成形過程。
二、細胞凋亡的形態學和生物化學特征
●細胞凋亡與壞死(necrosis)
●細胞凋亡的形態學特征
●細胞凋亡的生化特征
●誘導細胞凋亡的因子
●細胞凋亡的檢測
細胞凋亡與壞死(necrosis)
●二者的主要區別是，細胞凋亡過程中，細胞質膜反折，包裹斷裂的染色質片段或細胞器，然后逐漸分離，形成眾多的凋亡小體（apoptotic bodies），凋亡小體則為鄰近的細胞所吞噬。整個過程中，細胞質膜的整合性保持良好，死亡細胞的內容物不會逸散到胞外環境中去，因而不引發炎癥反應。相反，在細胞壞死時，細胞質膜發生滲漏，細胞內容物，包括膨大和破碎的細胞器以及染色質片段，釋放到胞外，導致炎癥反應
細胞凋亡的形態學特征
◆凋亡的起始：細胞表面的特化結構如微絨毛消失，細胞間接觸的消失，但細胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內質網上脫離，內質網囊腔膨脹，并逐漸與質膜融合；染色質固縮，形成新月形帽狀結構等形態，沿著核膜分布
◆凋亡小體的形成：核染色質斷裂為大小不等的片段，與某 些細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞質膜所包圍。細胞表面產生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個的凋亡小體
◆凋亡小體逐漸為鄰近的細胞吞噬并消化
細胞凋亡的生化特征
◆細胞凋亡的主要特征是形成大小為
180～200bp特征性的DNA ladders
◆凋亡細胞組織轉谷氨酰***酶tTG
（tissue Transglutaminase）積累并達
到較高水平
誘導細胞凋亡的因子
◆物理性因子，包括射線（紫外線，? 射線等），
較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等
◆化學及生物因子：包括活性氧基團和分子，DNA
和蛋白質合成的抑制劑，激素，細胞生長因子，腫
瘤壞死因子?（TNF?），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等
細胞凋亡的檢測
◆形態學觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察
◆DNA電泳：DN***段就呈現出梯狀條帶
◆TUNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標記法
◆彗星電泳法（comet assay）
◆流式細胞分析
根據凋亡細胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA
產生激發熒光，用流式細胞儀檢出凋亡的亞二倍體細
胞，同時又能觀察細胞的周期狀態。
三、細胞凋亡的分子調控機理
●線蟲(C.elegans)凋亡研究發現ced3,ced4基因促進
細胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制
細胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-
1-converting enzyme)，即Caspase1
●Caspase家族與凋亡
●Bcl-2家族、線粒體與細胞凋亡
●細胞凋亡的分子機理
Caspase家族與凋亡
◆Caspase家族
·Caspase活性位點是半胱氨酸(Cysteine)，
裂解靶蛋白位點是天冬氨酸殘基后的肽
鍵，因此稱為Cysteine aspartic acic specific
protease，即Caspase
◆Caspase活化
◆胞外信號分子誘導的細胞凋亡途徑
Caspase活化
Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點裂解活化或自身活化
胞外信號分子誘導的細胞凋亡途徑
·凋亡信號通路
當細胞接受凋亡信號分子(Fas,TNF等)后，凋亡細胞表面信號分子受體
相互聚集并與細胞內的銜接蛋白(Adaptor protein)結合，這些銜接蛋白又
募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產生級聯反應，使
細胞凋亡
·下游Caspases活化后，作用底物：
裂解核纖層蛋白，導致細胞核形成凋亡小體；
裂解DNase結合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNA Ladder;
裂解參與細胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細胞皺縮、
脫落，便于細胞吞噬；
導致膜脂PS重排，便于吞噬細胞識別并吞噬。
Bcl-2家族、線粒